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抗肿瘤类靶向制剂靶向性评价方法研究进展

Research progress in targeting evaluation methods for

anti-tumor targeted drug delivery system

作 者

孙悦，刘倩，杨化新

中国食品药品检定研究院

摘 要

与传统制剂相比，靶向制剂可以提高药物选择性、降低不良反应、增强疗效、提高患者顺应性等，成为新药研发的热点。

建立科学合理的靶向性评价技术与方法，对保证该类药物制剂的安全、有效、质量可控具有重要作用。本文对抗肿瘤类靶向制剂的靶向机制以及注册和上市情况进行了概述，并重点介绍了靶向性评价技术与方法，为抗肿瘤类靶向制剂的质量研究和控制提供参考。

正 文

与普通制剂相比，靶向制剂可以提高药物选择性、降低不良反应、增强疗效、提高患者顺应性等，已成为新药研发的热点。

2015 年版《中华人民共和国药典》四部收载了微粒制剂指导原则，再次论述了靶向制剂，即具有靶向作用的药物制剂通常称为靶向制剂。

但有关靶向制剂的靶向性评价论述较少，建立科学合理的靶向性评价技术与方法，对保证该类药物制剂的安全、有效、质量可控具有重要的指导作用。

本文对靶向制剂的靶向机制，以及注册和上市的靶向制剂进行了概述，并重点介绍了抗肿瘤类靶向制剂靶向性评价的技术与方法，为靶向制剂的质量评价和质量控制研究提供参考。

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靶向制剂概述

靶向制剂系采用载体将药物通过循环系统浓集于或接近靶器官、靶组织、靶细胞和细胞内结构而发挥药物作用，从而提高疗效并显著降低药物对其他组织、器官及全身的不良反应。

靶向制剂从释药部位上可分为3 类:

一级靶向制剂，系进入靶部位的毛细血管床释药;

二级靶向制剂，系进入靶部位的特殊细胞( 如肿瘤细胞) 释药;

三级靶向制剂，系药物作用于细胞内的一定部位。

靶向制剂从作用机制上，又可分为被动靶向制剂( passive targeting preparation)、主动靶向制剂( active targeting preparations)、物理化学靶向制剂( physical and chemical targeting preparation) 。

1. 被动靶向制剂

被动靶向制剂，即自然靶向，通过载体的粒径、表面性质、形状、面容比等特殊性，使药物通过正常的生理过程，在体内特定靶点或部位富集，主要是未经配体或抗体修饰的纳米粒、脂质体、聚合物胶束等。

1.1 机制

EPR效应:

健康血管的内皮细胞壁由内皮细胞紧密连接排列组成，可以防止血液中的大颗粒渗漏出血管。

在实体瘤无限制增殖过程中，由于营养供应限制，会诱导血管再生。在肿瘤病理学中，血管再生或血管新生会导致血管膜孔变大( 可达到600 nm) 和淋巴引流障碍，即肿瘤的高通透性和滞留效应( enhanced permeability and retention effect，EPR) ，被动靶向制剂通过对流或扩散从肿瘤毛细血管漏窗转运到肿瘤间质或细胞，小于200 nm的微粒首先在肿瘤间质积累。

粒径:

循环时间、蛋白吸收、生理分布、免疫原性、内化、胞内运输、降解等微粒在体内的几项重要功能都取决于粒径。在体循环中，不同粒径的微粒累积部位不同。

在一定范围内，粒径越小，对实体瘤的穿透能力越强，而在肿瘤部位的滞留能力则小于大粒径微粒。

通过粒径智能化调节，可实现被动靶向制剂同时具有良好的肿瘤滞留性和渗透性，即利用EPR效应使大粒径制剂在肿瘤部位滞留，然后通过环境响应性使粒径降低，提高其在肿瘤部位的穿透性

表面性质:

通常，微粒在体内循环时间越长，靶向累积效果越好。用PEG 链、两性离子聚合物或肽对微粒进行表面改性，可以伪装微粒使其获得隐身特性; 这可以阻止血清蛋白的调理作用与被Kupffer细胞或肝细胞吸收，增加循环时间。

形状:

同一种微粒，形状不同，在体内运输行为也不同。在小鼠体内正交的E0771 乳腺肿瘤细胞中，长44 nm［纵横比( AR) = 9］的纳米棒比纳米微球( 33 ～ 35 nm) 穿过血管壁快4 倍，渗透作用高1.7 倍。

1.2 应用

目前已上市的抗肿瘤类被动靶向制剂有11 种( 见表1) ，进入临床研发阶段的靶向制剂有若干，本文列出了10 种( 见表2) 。

被动靶向制剂常用载体有纳米粒、聚合物胶束、脂质体。DaunoXome、Doxil、Marqibo Kit、力朴素 等均为脂质体，其中力朴素是国内批准的第一个脂质体药物，也是国际首个上市的注射用紫杉醇脂质体药物。

对Oncaspar，Genexol-PM 等进行表面改性，增加循环时间。

2. 主动靶向制剂

主动靶向制剂是通过作用于特定靶点抑制肿瘤细胞增殖和生长。主要包括小分子靶向制剂、单克隆抗体、抗体偶联药物以及靶向纳米载药系统。

2.1 机制

小分子靶向制剂，如吉非替尼、阿法替尼、索拉非尼等激酶抑制剂可以进入细胞内，与相应的靶点结合，抑制血管的生成与肿瘤细胞的增殖，从而产生抑瘤效果。单克隆抗体特异性识别受体胞外区，干扰信号转导途径，调控参与癌细胞增殖的原癌基因;

此外，单克隆抗体与受体的结合还可以激发补体介导的细胞杀伤效应( complement dependent cytotoxicity，CDC) 和抗体依赖的细胞杀伤效应( antibody- dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC) ，发挥间接抗肿瘤作用。

目前，研究较多的是抗体偶联药物( antibody drug conjugates，ADCs) 与靶向纳米载药系统。

抗体偶联药物由抗体、细胞毒药物、偶联链三部分组成，

抗体作为递送载体与肿瘤相关抗原特异性结合，使细胞毒药物送至靶部位。

靶向纳米载药系统是在药物载体表面修饰抗体、糖蛋白、脂蛋白、转铁蛋白、多肽类、叶酸、核酸等适当基团，使其与靶细胞的受体或抗原特异性结合，在被动靶向基础上，将药物浓集于靶部位。

2.2 应用

目前已上市的抗肿瘤类主动靶向制剂有41 种( 见表3) ，进入临床研发阶段的有若干，本文列出了14 种( 见表4) 。

表3 全图请见PDF版原文

3. 物理化学靶向制剂

物理化学靶向制剂能够自主或在外力控制下到达理想位置释药。利用靶区微环境的变化，如pH、酶活性、氧化还原反应，或者给予外力，如光照、超声、磁场等来影响载药微粒的位置，进而实现药物的靶向释放。

如ThermoDox是一种将多柔比星包裹在脂质体内的热敏抗癌药，该脂质球体被加热到特定温度时，其外壳的物理结构被快速改变，形成多个小开口，抗癌药物即可从中快速释放出来，目前已用于肝癌与乳腺癌的临床研究中。

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靶向制剂的质量评价方法

为保证药物安全有效，我们需要建立系统和有效的靶向制剂质量控制与评价体系，进而为上市产品与正在审批阶段的靶向制剂的质量评价提供理论基础和技术支撑。

靶向制剂的关键质量属性包括形态、粒径、表面电性、包封率、释放度与突释率、抗体偶联比率、游离药物含量、亲和力、纯度、生物学活性、靶向性等。这些质量属性的表征和评价方法主要分为理化和生物学分析与评价方法，靶向性的评价参数与方法本文将重点介绍。

1. 理化评价方法

形态检查:

同一种微粒，形状不同，在体内运输行为也不同。微观形态的观察可使用扫描电镜( SEM) 、透射电镜( TEM) ，以及原子力学显微镜( AFM) 。

粒径测定:

测定粒径方法有动态光散射( DLS) 、激光衍射法( LLD) 、SEM、TEM 等方法。

Schdlich 等使用HT20 结肠癌和A2780 卵巢癌2 种不同的肿瘤异种移植模型，研究荧光标记的PLA-PEG 聚合物纳米颗粒细胞积累与粒径关系。

直径为111 与141 nm的颗粒在肿瘤中有效累积，而较大的颗粒( 166 nm)在肝脏中被快速清除。目前，载体粒径与细胞摄入效率之间关系值得深入研究。

药物抗体偶联比率( DAR) :

药物抗体偶联比率是主动靶向抗体偶联药物( ADC) 的一项重要质量属性，它决定了可递送至肿瘤细胞，以及可直接影响安全性和有效性的载药量。

测定方法有紫外-可见光分光光度法( UV-Vis) 、疏水作用色谱法( HIC) 、质谱法。UV-Vis 利用抗体与偶联药物的最大吸光值及消光系数，可计算出抗体与药物各自的浓度，方法简单。

Zeta 电位测定:

Zeta 电位测定的结果可以用来预测微粒体系的储存稳定性。

纳米粒、微球等表面的电荷主要由微粒的吸附、解离以及制作过程中相对电子亲和力的不同等引起。

Zeta 电位越高( 绝对值) ，由于同电荷相斥效应，粒子间的斥力就越大，体系越不容易发生聚集，胶体就可保持稳定。

此外，Zeta 电位高时进入扩散层的反离子多，而吸附层的反离子少，由于双电层中离子有较强的水化作用，胶粒周围就会产生水化膜，水化膜可以阻止胶体的合并，Zeta 电位越高，扩散层越厚，水化膜也就越厚，胶体的稳定性就越好。

表面电性、载药量、包封率、释放度与突释率等反应靶向制剂质量的理化参数表征方法，已有相关文献介绍，本文不再赘述。

2. 生物学评价方法

2.1 药效测定

药效是靶向制剂的关键质量属性，药物做成靶向制剂的前提是能够保证同等或更强的药效，而具有更少的不良反应，所以药效测定是评价靶向制剂靶向性的重要环节。

其中，抗肿瘤类靶向制剂的测定方法有比色法、SRB法、集落形成法、台盼兰染色法、体内实验法等。实验室根据具体情况可以选择合适的方法。

MTT 比色法:

又称四氮唑盐还原法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臢并沉积在细胞中，而死的细胞则无此功能。

用二甲基亚砜溶解细胞中的甲臢后，在一定波长下用酶标仪测定吸光值，可间接反映活细胞数量。

MTT 法操作简单、经济、无放射性，使用较多，但若甲臢溶解不完全会对实验结果造成影响。CCK-8，XTT 与MTS 是新合成的四氮唑盐衍生物，被活细胞中线粒体内的脱氢酶降解而产生棕黄色水溶性的甲臢，与MTT 法相比，提高了灵敏度，但成本较高。Bernabeu 等报道了载PTX 的PCLTPGS纳米粒与市售Abraxane 相比，对MCF-7 及MDA-MB-231 乳腺癌细胞均有更强的药效。

磺酰罗丹明B 比色法:

磺酰罗丹明B( sulforhodamine B，SRB) 是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合，在540 nm 波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，可用作细胞数的定量检测。与MTT 法相比，SRB法敏感、准确，但染色步骤多，操作繁琐，易造成人为误差。

ATP 生物发光法:

细胞内源性的三磷酸腺苷( adenosine triphosphate，ATP) 含量可以反应细胞的活性。

ATP 与荧光素-荧光素酶复合物作用，发生生化反应产生荧光，通过检测荧光强度，反映ATP 的含量，进而确定活细胞数。

Johannes 等用Cell Titer-GLO发光细胞活性检测试剂盒对制备的SW43-DOX( σ2 受体配体与多柔比星偶联物) 进行测定，与单独给多柔比星相比，偶联物对Hep 3B，HT-29 细胞的EC50值分别减小了2． 9 和8 倍。

体内实验法:

由于动物肿瘤移植模型与临床疗效之间的相关性不强，通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价细胞毒类抗肿瘤药物的有效性。通过测量瘤径的方式，动态观察受试物种抗肿瘤效应。

肿瘤直径测量次数据移植瘤生长情况而定，一般为每周2 ～ 3 次，每次测量同时还需称鼠重。

Karmali 等制备并比较了修饰LyP-1 与CＲEKA多肽的abraxane 对荷MDA-MB-435 肿瘤的异种移植裸鼠肿瘤生长的影响，与游离abraxane 相比，LyP-1-abraxane 能够显著抑制肿瘤生长。肿瘤体积( tumor volume，TV) 的计算公式为:

其中a，b 分别表示最小与最大肿瘤直径。据测量结果计算出相对肿瘤体积( relative tumor volume，RTV) ，RTV= Vt /V0。

其中V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。

抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率

TRTV:治疗组RTV; CRTV:阴性对照组RTV。

疗效评价标准为: T/C ＞ 40%为无效; T/C≤40%，并经统计学处理P ＜0.05 为有效。

2.2 生物相容性

生物相容性是指载体材料在体内所引起的变化，包括血液相容性和与组织的相互作用。

血液相容性要求是: 溶血性低、血红蛋白变性度小、对红细胞形态无影响等。

检测方法有: 测定微球与血液接触时，红血球中血红蛋白释放量( 溶血试验) ，观察红细胞与微球接触时形态变化; 用血凝动力学实验考察凝血量和凝血时间; 用血小板聚集仪考察血小板与载体相互作用情况等。

与组织的相互作用主要指微球进入人体后，细胞在其表面的贴附及增殖情况、对组织的刺激情况等。

体外评价时，可把微球或载体直接与细胞培养液一起进行细胞培养，观察细胞形态与数量的变化。动物体内评价时，可作病理切片，进行病理检查。

2.3 靶向性评价法

靶向性是靶向制剂最重要的属性，对其靶向性进行考察，以明确是否具有特定部位浓集的作用。

药动学法:

经典方法是药动学实验，考察药物的组织器官分布情况。

在传统给药中，假设药理反应与血浆药物浓度是成线性关系，由于靶向制剂在不同器官、组织中的到达、滞留和药物释放的时间不同，因此可以对模型动物给药后，在预定时间点取靶器官与非靶器官，组织匀浆法处理样品，测定药物含量，绘制血药曲线，评价药物制剂的靶向性。

为了评价制剂的靶向性，一般以靶向效率( TE) 、相对靶向效率( RTE) 、靶向指数( TI) 来评价剂型改变后，药物在动物体内分布的靶向性特征及变化。TE，RTE，TI 计算公式分别为:

其中，n 表示靶向制剂，s 表示非靶向制剂，l 表示靶组织，i 表示非靶组织。

用药动学程序，计算各组织的AUC0 ～ t，Cmax及MRT( 平均滞留时间) 值，按上述公式对靶向制剂的靶向性进行评价。

TE 反映了一个释药系统对靶组织和非靶组织的药物分布效率，RTE 反映的是同一药物对不同组织的趋向性差异，TE 越大，靶向性越好，RTE为正值，说明靶向性增强，RTE为负值，说明药物在该组织中无靶向性。TI 可以反映药物对组织的靶向性，TI ＞ 1 则表明药

物在该组织中有靶向性，TI≤1 表明无靶向性，TI 越大靶向效果越好，药物在该组织中分布越多。

因TE，RTE 和TI 都是以AUC 作为比较单位而得到的参数，故能充分反映药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的全过程，因此可全面体现药物在整个实验时间段内分布的情况。

放射性同位素测定技术:

方法1 是在微粒表面标记放射性同位素，进行实验动物整体自显影或活体动态显影，考察不同时间的药物在动物体内不同器官的分布情况，此技术虽能直观地看出分布概况，但定量程度低，不适宜进行分布的定量评价。

方法2 是标记载体后制备微粒，给药后，在适宜时间处死实验动物，测定各组织或器官放射性强度，考察体内过程，此方式是以微粒或载体的体内过程间接描述药物的体内过程。

方法3 是放射性同位素标记药物后制备微粒，测定给药后不同时间动物体内各组织或器官中放射性强度以研究体内过程，该方法灵敏度高且重现性好。

活体荧光成像系统:

活体荧光成像( biofluore scence imaging，BFI) 是一种非侵入性成像技术，可用于评价靶向制剂在体内的靶向性，无污染且操作较简单。对靶向制剂进行荧光标记，注射到动物体内后，利用光学检测设备对活体内的荧光信号进行实时、原位检测。

由于红光对生物组织穿透能力强，成像信噪比高，所以近红外荧光是活体成像的最佳选择。常用的活体成像染料有AlexaFluor，IRDyes，CY7，DIR等。

Palframan 等用BFI 技术对肿瘤坏死因子-α 抑制剂赛妥珠单抗、阿达木单抗、英夫利昔单抗在关节炎模型鼠中正常组织与炎症组织的分布进行了研究。

Mérian 等报道过2 种具有相同粒径，分别包载DID， ICG 不同荧光染料的脂质纳米粒在小鼠体内分布，发现分布有所不同，所以需要用定量的方式来进一步确证纳米载体驱动药物在体内的分布。

激光扫描共聚焦显微镜:

激光扫描共聚焦显微镜( confocallaserscanningmicroscope，CLSM) 可用于实

时观测在细胞水平的释药行为，以评价靶向制剂的靶向性。

生活状态下的细胞以质膜的方式将大分子物质摄入细胞内，并由此引发相关界膜小泡的生成、融合、转运及分检等一系列连续过程，是靶向给药系统与相应靶细胞作用内化的一种最为基本而又十分重要的模式。

Li 等使用CLSM 技术观测了SiO2@ AuNPs 在细胞质中0 ～ 24 h 的释药行为。可以通过动态比较细胞内药物的相对荧光值，评价靶向制剂的靶向性。

流式细胞术:

流式细胞术( flow cytometry，FCM)是一种对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。

Qing 等用流式细胞仪测定样品与阴性对照相比的荧光强度增量，来表示靶向药物细胞内化的相对量。

Taghdisi 等制备并用FCM 分析了配体-树枝状聚合物-表柔比星复合物在MCF-7 与C16 细胞( 靶细胞) 中的荧光强度显著大于游离的多柔比星( P ＜ 0.05) ，而MCF-7 细胞荧光强度显著小于C16 细胞( P ＜ 0.05) ，这说明靶向制剂可有效区分靶细胞与非靶细胞。

邻位连接技术( proximity ligation assay，PLA) :

邻位连接技术是一种新型的蛋白检测技术，灵敏度高，可用于肿瘤标志物的检测。

该技术是将一对寡核苷酸单链分别标记在靶蛋白结合试剂( 如单克隆抗体) 上作为邻位探针，当2 个探针因为识别同一个靶蛋白而空间上靠近时，寡核苷酸自由末端拉近，在一个外加连接寡核苷酸作用下发生杂交实现邻位连接。

然后连接酶以连接探针为模板将2 条邻位探针的辅助核酸序列连接起来，从而形成一条完整的单链。

加入引物、Taqman 探针和Taq 酶后，上游引物以此条完整单链为模板合成互补链，形成DNA 双链。之后便是一个完整的Taqman 探针实时PCR过程，最后通过检测荧光信号便可知道被测蛋白的存在及其含量。

Ohkubo 等用邻位连接技术评估了HSP90 α 和β 抑制剂TAS-116 在细胞水平上对HSP90 的选择性，数据显示在0． 3 mmol·L － 1 浓度水平时，TAS-116 能够抑制HSP90。

PK/PD 模型的应用:

将非临床有效性研究( 包括体外模型和体内模型结果) 、伴随的药动学研究结果与人体临床早期药代信息相结合，以合理预测临床有效浓度和给药剂量。

以阿西替尼为例，其研究就是根据在裸鼠移植瘤模型中进行的TGI( 肿瘤生长抑制率) 研究以及非线性回归( sigmoidal 剂量-效应) 曲线分析，估计其药理学有效性浓度( Ceff) 。

再根据其人血浆蛋白结合率，推算出人的总Ceff。假设患者的PD 参数与小鼠MV522 肿瘤相似，结果预计5 ～ 10 mg 的阿西替尼( BID) 可达到40% ～ 60% TGI。

采用PK/PD 模型进行人体剂量方案探索是目前国外靶向治疗药物早期开发中常采用、用于提高临床开发成功性的新的有效方法。

对将来国内此类药物开发的指导意义较大，建议逐步系统研究并指导国内应用。

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展 望

我国靶向药物制剂研究主要集中在如何解决传统抗肿瘤药物不良反应多、体内靶向性差的缺陷，同时注意提高药物包封率和载药量，增加药物稳定性，以期获得载药量大、稳定性好、靶向性强的药物制剂。

靶向药物制剂作为新一代肿瘤治疗的方法，具有广阔的前景。

目前，虽然对于包封率、载药量、释放度与突释率等理化评价指标已经建立，但对于成药的靶向制剂的靶向性评价的体内外方法有待研究与规范，对新型靶向性载体材料的有效性和安全性评价方法尚需完善，靶向药物制剂理化性质与靶向性关系还需进一步研究。

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说明

来源：中国新药杂志2017 年第26 卷 第7 期

本文由凡默谷原创排版与编辑，如转载，请注明来源。

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